病毒无基因攻略

病毒无基因攻略

1、稳定转染细胞株可应用于重组蛋白、抗体生产、基因编辑、功能性研究和移植瘤构建等多种实验，已成为日常实验操作的一部分。目前构建稳定转染细胞株最常用的方法还是使用慢病毒感染细胞。慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型细胞，适用范围广。

2、但是很多同学特别是新手也会一直为慢病毒感染实验愁眉苦脸，遇到例如：加入慢病毒后细胞状态差或者死亡、的亮度弱、转染效率低下等问题。由于整个慢病毒感染实验周期耗时长，对后续实验影响大，下面舒桐小编提供一份慢病毒转染全攻略，助大家在慢病毒转染实验中乘风破浪。一、慢病毒的储存与稀释。

3、1、病毒液储存：如果短时间，一周，内进行实验，可以将病毒液暂放置4℃保存；如不能在短期内全部使用，需将慢病毒液分装后置于–80℃冰箱保存，根据每次的使用量进行分装，将定量的病毒液置于冻存管中，做好日期和储存量标记，封口膜密封，病毒液可存放于-80℃冰箱约6个月，如储存时间超过6个月，建议使用前重新测定病毒滴度。在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，反复冻融会降低病毒滴度，每次冻融会降低病毒滴度10%-50%；我司出库前对病毒液行了分装，100μ/，收到后直接放置-80℃保存即可。如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

4、滴度测定方法敬请期待下期细胞实验专栏—新手必看：慢病毒感染全攻略2、病毒液稀释：当需要稀释病毒时，将病毒液取出，置于冰上融解，使用或培养目的细胞的无血清培养基稀释。病毒液稀释过程，逐步稀释法，二、慢病毒感染细胞实验步骤。

5、慢病毒对不同细胞系亲嗜性不同，在使用慢病毒前可以查阅相关文献，了解慢病毒对目的细胞系的感染复数值，在用于病毒感染细胞的研究中时，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，如果无相关文献支持，可以通过预实验获取合适的值。以24孔培养板为例，进行目的细胞系和293细胞，平行对照，的感染预实验，按照不同的值设置若干感染孔，可依据经验值设置3个左右梯度，并根据值和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

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1、(1)1：准备细胞。在24孔培养板接种若干孔处于对数生长期的目的细胞和平行对照293细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30%-50%之间。放入37℃，5%2培养箱中培养过夜，针对贴壁细胞，(2)2：病毒感染，1/2小体积感染法，

2、4°保存的病毒，取出后轻轻用移液器混匀；-80℃冻存的病毒在冰上融化后使用。接着感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，观察细胞生长状态，如细胞状态好，细胞状态对转染影响较大，则可以开始实验。

3、我司根据实验经验，若想得到较好的感染效率，我们推荐1/2小体积感染法，即病毒感染时，加入1/2体积新鲜培养液，慢病毒感染4后补足至培养体积。如：24孔板的培养液体积为500μ，1/2培养体积为250μ，其他大小的培养皿的培养液体积见下表。吸去培养器皿中的旧培养基，用清洗两次，加入1/2体积新鲜培养基。根据摸索的值，加入合适体积的病毒进行感染，每孔加病毒量，μ，=细胞数/病毒滴度，/，×1000，使用移液器吸取准确体积的病毒液加入目的细胞和对照细胞中。

4、将病毒液和培养基混匀，放于二氧化碳培养箱(37℃、5%2)孵育培养。4后补足至完全培养体积继续培养。

5、(3)3：细胞换液。一般加入病毒液24小时后，弃去含病毒的培养液，换上新鲜完全培养液，继续在培箱中进行培养，该时间可根据细胞感染后状态具体调整，若感染后细胞明显皱缩，状态差则建议4-6进行换液；若感染后细胞状态一直良好，也可以将换液时间延长至感染后48-72，(4)4~5：荧光观察/抗性药物筛选。加入病毒48-72小时后，对于带报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测荧光强度，对于携带或者其他抗性基因的病毒，换上含适当浓度抗生素完全培养液，标准终浓度范围为1-10μ/，不同细胞系工作液浓度不同，可查阅文献或者预实验寻找最适筛选浓度，进行稳定表达细胞株筛选。